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    TOP10感受態適用于高效的DNA克隆使用

    發布時間:2021/8/9 10:22:16      閱讀次數:613

      TOP10感受態是一種用于鋪制與培養質粒平板和粘粒平板的重級缺陷的抑制型菌株.其中φ801acZΔM15基因的產物可與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實現α-互補,可用于藍白斑篩選.該菌株適用于高效的DNA克隆和質粒擴增,能保證高拷貝質粒的穩定遺傳.
      保存:所有受體菌均為甘油保存,-70℃可長期保存,-20℃可保存一年.感受態為-70℃保存,運輸均為干冰.
      TOP10感受態注意事項:
      1 感受態細胞應保存在-70℃,運輸過程中應放入干冰中.
      2 感受態細胞不可反復凍融,否則其轉化效率將會降低.
      3 轉化時,轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA量過多或體積過大反而會降低轉化效率.轉化時DNA體積要小于感受態細胞體積的十分之一.
      4 實驗過程中應嚴格無菌操作,防止其它DNA的污染,避免為以后的篩選 鑒定帶來影響.
      5 轉化率的計算:轉化率=產生菌落的總數/鋪板DNA總量6 為防止轉化實驗不成功,可以保留部分連接產物,以重新轉化,將損失降低.
      TOP10感受態操作方法:(以下各步驟均為無菌操作)
      1 將感受態細胞置于冰上融化,如需分裝可將剛融化的細胞懸液分裝到無菌預冷的離心管中.一次轉化感受態細胞的用量為50-100ul,可以根據實際情況分裝使用.以下實驗以100ul感受態細胞為例.
      2 向感受態細胞懸液中加入需轉化的目的DNA,注意目的DNA的體積不要超過感受態細胞懸液體積的十分之一,輕輕旋轉離心管以混勻內容物,冰浴放置30分鐘.
      3 將離心管置于42℃水浴中放置60-90秒,然后快速轉移到冰浴中放置2-3分鐘,注意不要搖動離心管.
      4 向離心管中加入500ul無菌無抗的SOC或LB培養基,37℃150rpm振蕩培養1小時.目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達,使菌體復蘇.
      5 取適量已轉化的感受態細胞涂布含相應抗生素的SOC或LB平板,37℃倒置培養12-16小時.涂布用量可根據具體實驗來調整,如轉化的DNA總量較多,可取100ul左右的轉化產物涂板;反之,如轉化的DNA總量較少,可取200-300ul的轉化產物涂板.如果預計的克隆較少,可通過離心后吸除部分培養液,懸浮菌體后將其涂布于一個平板中.涂布剩余的菌液可4℃保存,如果次日的轉化菌落數過少可以將剩下的菌液再涂布新的平板.
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